Изучение реакции Хилла. Лабораторные работы

Лабораторные работы

В 1939 г. Роберт Хилл (Hill) работая в Кембридже, обнаружил, что изолированные хлоропласты способны высвобождать кислород в присутствии окисляющего агента (акцептора электронов). Это явление получило название реакции Хилла.

Некоторые химические вещества способны заменять природный акцептор электронов НАДФ. Одним из таких веществ является синий краситель ДХФИФ (2,6-дихлорфенолиндофенол), который после восстановления становится бесцветным:

Выделение хлоропласто

Материалы и оборудование
Листья шпината, салата латука или капусты
Ножницы
Охлажденная ступка с пестиком (или мешалка, или бы¬
товой миксер)
Марля или нейлон
Фильтровальная воронка
Центрифуга и пробирки для центрифугирования
Водяная баня со льдом и солью
Стеклянная палочка
Растворы (см. примечания)
0,05 М фосфатный буфер, pH 7,0
Среда для выделения хлоропластов
Раствор ДХФИФ (реакционная среда)

Методика

Хлоропласты можно выделить из измельченных листьев шпината, салата латука или капусты, используя охлажденную среду подходящей осмотической и ионной силы и pH. К таким средам относятся 0,4 М раствор сахарозы, 0,01 М KCl и 0,05 М фосфатный буфер с pH 7,0. Чтобы сохранить биохимическую активность выделяемых образцов, все используемые растворы и посуда должны быть охлажденными.

Все процедуры следует проводить максимально быстро, поэтому необходимо сначала внимательно изучить метод и оборудование. Данный метод позволяет выделить достаточно большое количество хлоропластов, чтобы их могли изучать несколько групп студентов, если нет возможности обеспечить выделение хлоро- пластов каждой группой.

1. Разрежьте ножницами три небольших листа шпината, салата латука или капусты, удалив жилки и черенки. Поместите их в холодную ступку или стакан измельчителя, содержащие 20 мл холодной среды для выделения (можно пропорционально увеличить количество измельченных листьев и объем среды).

2. Энергично и быстро разотрите (время измельчения около 10 с).

3. Поместите в воронку четыре слоя марли или нейлона, смочите их холодной средой для выделения.

4. Профильтруйте через воронку полученный гомогенат. Фильтрат соберите в предварительно охлажденные центрифужные пробирки, помещенные в водяную баню со льдом и солью. Края марли соберите вместе и тщательно отожмите в пробирки.

5. Проследите, чтобы во всех пробирках содержалось примерно одинаковое количество фильтрата.

6. Если ваша настольная центрифуга имеет одну определенную скорость, время центрифугирования должно составлять 2-5 мин (необходимо, чтобы появился небольшой осадок, но время центрифугирования должно быть минимальным). Если же у используемой центрифуги скорость можно менять, центрифугировать фильтрат следует 1-2 мин при 100-200 g. Надосадочную жидкость центрифугируйте еще 5 мин при 1000-2000 g (этого времени достаточно для получения небольшого осадка, содержащего хлоропласты).

7. Слейте надосадочную жидкость. При помощи стеклянной палочки ресуспендируйте осадок в одной из центрифужных пробирок, добавив в нее около 2 мл среды для выделения. Образовавшуюся суспензию перенесите во вторую центрифужную пробирку и вновь ресуспендируйте осадок. (Если в работе участвует более одной группы студентов, добавьте по 2 мл среды для выделения в каждую центрифужную пробирку и используйте в каждой группе по пробирке.)

8. Храните полученную суспензию хлоропластов в водяной бане со льдом и с солью и используйте как можно быстрее.

Литература. Биология : в 3 т. Т. 1 / Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут ; под ред. Р. Сопера

AOF | 08.01.2021 18:29:01