Теперь суспензию хлоропластов можно использовать для изучения реакции Хилла. Раствор ДХФИФ должен быть комнатной температуры.
Подготовьте четыре пробирки, в которые налейте:
2) 0,5 мл среды для выделения +5 мл раствора ДХФИФ. Оставьте пробирку на ярком свету;
3) 0,5 мл суспензии хлоропластов +5 мл раствора ДХФИФ. Пробирку немедленно поместите в темное место;
4) 0,5 мл суспензии хлоропластов +5 мл дистиллированной воды. Эта пробирка будет служить цветовым стандартом, показывающим, каким должен быть цвет суспензии после восстановления ДХФИФ.
Через 20 мин запишите ваши наблюдения. Если у вас имеется колориметр, то за развитием реакции можно следить, измеряя уменьшение поглощения света красителем, поскольку в окисленной форме он синий, а в восстановленной — бесцветный. В таком случае образцы 2 и 4 следует готовить прямо в кюветах колориметра.
Поставьте красный (или желтый) фильтр и выставьте колориметр на ноль, используя суспензию 4 как контроль. Затем поместите в прибор кювету со смесью 1, немедленно снимите для нее показания и вновь поместите пробу на яркий свет. Продолжайте проводить измерения каждые З0 с. Постройте график скорости реакции. Когда восстановление полностью закончится, проведите измерения для образца
3. Восстановление самого красителя ДХФИФ можно оценить, измерив показания для образца 2, и используя в качестве стандарта среду для выделения; при этом прибор на ноль следует выводить тоже по раствору среды для выделения. В идеале для полного восстановления требуется около 10 мин.
Примечания
Приготовьте следующие растворы:
Доведите дистиллированной водой до 500 мл и храните раствор в холодильнике при 0—4 °С.
Растворите в фосфатном буфере при комнатной температуре, доведите объем до 250 мл. Храните в холодильнике при 0—4 °С.
Растворите в фосфатном буфере при комнатной температуре, доведите объем до 250 мл. Храните в холодильнике при 0—4 °С. Используйте при комнатной температуре. (ВНИМАНИЕ. Хлорид калия является кофактором в реакции Хилла).
7.17. Какие изменения (если таковые имеются) вы наблюдаете в пробирке 1?
7.18. Для чего предназначаются пробирки 2 и 3?
7.19. Какие еще органеллы, по вашему мнению, могут содержаться в суспензии хлоропластов?
7.20. Как вы можете доказать, что они не участвуют в восстановлении красителя?
7.21. Почему среда для выделения должна быть охлажденной?
7.22. Почему среда для выделения готовится на фосфатном буфере?
7.23. Что является а) донором и б) акцептором электронов в реакции Хилла?
7.24. Во время реакции Хилла ДХФИФ действует между акцептором электронов Х и ФС1 (см. рис. 7.14), при этом выделяется кислород.
К какому типу фосфорилирования, по вашему мнению, относится реакция Хилла: циклическому, нециклическому или и тому, и другому? Обоснуйте свой ответ.
7.25. На рис. 7.23 показано, как выглядят хлоропласты после того, как их использовали в приведенном выше опыте.
На фотографии видны те изменения, которые происходят при переносе хлоропластов из гипертонической среды для выделения, содержащей сахарозу, в гипотоническую реакционную среду.
а) Чем отличается внешний вид хлоропластов, показанных на рис. 7.23, от нормальных хлоропластов?
б) Попытайтесь объяснить, почему перенос хлоропластов в среду с недостатком сахарозы вызывает подобные изменения?
в) Почему желательно, чтобы эти изменения произошли до реакции Хилла?
7.26. Какое, на ваш взгляд, значение имеет открытие реакции Хилла для понимания механизмов фотосинтетического процесса?
Литература. Биология : в 3 т. Т. 1 / Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут ; под ред. Р. Сопера
